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WISSEN
F.A.Q. -
Häufig gestellte Fragen
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1.
Was kann ich unter Zielen oder Isolationszielen
verstehen?
Ziele können Zellen oder Proteine aus Vollblut,
Zellkulturen, Primärzellisolationen oder Nabelschnurblut
sein. Alle Ziele werden aufgrund unterschiedlicher
Oberflächenmoleküle (Proteine, Kohlenhydrate,
etc.) isoliert, dass bedeutet, das Fängerpartikel
mit den komplementären Antikörpern eingesetzt
werden müssen, welche an die Zielmoleküle
binden und so das Ziel festhalten. Das Sieb mit
der entsprechenden Maschenweite hält anschließend
die gebundenen Ziele zurück. Die Ziele stehen
nun zur Weiterbearbeitung bereit. |
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2.
Wie funktioniert die pluriSelect Isolationstechnologie
und warum ist die Technologie einfacher als die
heute am Markt befindlichen Lösungen?
Auf die Einfachheit in der Anwendung unserer Kits
legen wir großen Wert! Die Technologie von
pluriSelect basiert auf der Isolation von Zielen
an sphärischen, isodiametrischen Fängerpartikeln,
auf deren Oberfläche ein Antikörper kovalent
gebunden ist. Die Ziele die fängerspezifische
Oberflächenmoleküle präsentieren,
werden an die Oberfläche der Fängerpartikel
gebunden. Die auf diese Weise gebundenen Ziele werden
anschließend über ein Sieb – oder
Siebkaskade – zurückgehalten und so aus
einem heterogenen Gemisch isoliert. |
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3.
Wo ist der Unterschied zum magnetischen Trennverfahren?
Die von pluriSelect verwendeten Partikel sind nicht
magnetisch! Das Trennverfahren basiert auf der Abtrennung
von isodiametrischen Partikeln mit speziellen Sieben.
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4.
Welche Fängerpartikel sind zurzeit verfügbar?
Da wir eine immer größere Zahl an Fängerpartikeln
bereitstellen werden, informieren Sie sich bitte
über die akutell erhältlichen Fängerpartikel
auf unserer Produktseite.
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5.
Sind die Materialien steril die ich von pluriSelect
erhalte?
Ja, alle im Kit enthaltenen Komponenten wie Fängerpartikel,
Mischzylinder, Siebe und Konnektor sind einzeln
steril verpackt. Jede Isolation kann somit unter
Laborbedingungen (Sterilwerkbank) antiseptisch /
steril durchgeführt werden. |
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6.
Kann ich die Fängerpartikel wieder von meinen
Zellen ablösen?
Ja! Wir haben ein physiologisches Ablöseverfahren entwickelt, welches das schonende Ablösen von den Fängerpartikeln innerhalb von 10 Minuten bei Raumtemperatur erlaubt.
Hierbei werden die Zellen von den Fängerpartikeln endgültig getrennt, so das die Zellen in einer Einzelzellsuspension für weitere Versuche zur Verfügung stehen. Alle erforderlichen Reagenzien sind im Kit enthalten.
Isolierte und von Fängerpartikeln abgelöste Zellen sind für alle downstream Applikationen wie z.B. FACS, Zellkulturexperimente oder Nukleinsäureisolation verwendbar. |
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7.
Kann ich meine isolierten Zellen auch mit den Fängerpartikeln
weiter kultivieren?
Ja! Speziell Zelllinien für Zellkulturexperimente
wachsen am Partikel weiter und können nach
ca. 48 Stunden (je nach Zelltyp) durch leichtes
Pipettieren von den Fängerpartikeln gelöst
werden. Danach wachsen sie wie gewohnt auf der Oberfläche
des Zellkulturgefäßes weiter. |
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8.
Probenvorbereitung: kann ich Zellen oder Proteine
direkt aus einer Vollblutprobe isolieren und warum
entfällt die Dichtegradientenzentrifugation
bei diesem Schritt?
Ja! Die pluriSelect Technologie ist speziell für
die Isolation von Zielen aus Vollblut entwickelt
worden. Die entsprechenden Fängerpartikel werden
direkt in eine entsprechende Menge von Vollblut
gegeben und im mitgelieferten Mischzylinder inkubiert.
Die Spezifität des Antikörpers ist maßgeblich
für die Isolation der Ziele und weitere Interaktionen
mit anderen Molekülen sind nicht hinderlich
für die Isolation. Es ist keine vorherige Erythrozytenlyse
oder eine Dichtegradientenzentrifugation nötig. |
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9.
Temperatur: kann ich die Ziele aus meiner Probe
bei 37° Celsius isolieren und warum muss ich
nicht bei 4° Celsius arbeiten?
Ja, die Isolation der Ziele kann bei 37° Celsius
oder Raumtemperatur durchgeführt werden. Eine
Kühlung der Probe kann, muss aber nicht erfolgen.
Die Isolation eines Ziels aus Vollblut ist so ausgelegt,
dass Sie nicht länger als 60 Minuten dauert.
Die rheologischen Eigenschaften von Vollblut tragen dazu bei, dass Ziele durch die Fängerpartikel
nicht unnötig gestresst werden. |
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10.
Kann ich aus einer Probe direkt mehrere, unterschiedliche
Zelltypen isolieren?
Ja, unbedingt! Gerade das ist das Besondere an der
pluriSelect Separationstechnologie! Aus einer Probe
können momentan bis zu 3 Ziele gleichzeitig
(Zellen und/oder Proteine) isoliert werden. Die
entsprechenden Fängerpartikel werden zusammen
mit einer Menge von 300 µl bis 15 ml Probe
in den Mischzylinder gegeben und inkubiert. Anschließend
wird die den Partikeldurchmessern entsprechende
Siebkaskade vorbereitet und die gebundenen Ziele
separiert. Auf den Sieben befinden sich nach den
Waschschritten die entsprechenden Ziele, die jetzt
weiterverwendet werden können. |
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11.
Zellstress: Wie niedrig ist die Apoptoserate
wirklich und warum ist sie im Vergleich zu anderen
Systemen so viel niedriger?
Durch die zeitsparende Isolation, die zum großen
Teil in der natürlichen Umgebung der Zielzellen
(Vollblut oder optimiertes Zellkulturmedium) erfolgt,
sind die Zellen kürzeren Phasen von physikalischem
Stress ausgesetzt. Zudem wird durch die geringere
Anzahl an Pipettier- und Zentrifugationsschritten
die mechanische Beanspruchung stark vermindert.
Die Zellen stehen in kurzer Zeit als Suspension
zur Verfügung und können sich ggf. in
Kultur rasch erholen. |
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12.
Probenvolumen: Für welche Probenvolumen ist
das System geeignet?
Theoretisch ist das Separationsverfahren für
jedes Probenvolumen geeignet. Derzeit wird es für
Separationen aus 300µl- 15ml angeboten. Im
nächsten Schritt sollen Separationssysteme bis
50ml entwickelt werden, gefolgt von einem System
für >50ml Probenvolumen. |
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13.
Welche Laborgeräte benötige ich für
meine Zielisolation?
Die pluriSelect Separationstechnologie steht für
minimalistischen Laborbedarf. Da die Probenvorbereitung
für die Separation von Zielen aus Vollblut
entfällt, wird keine Zentrifuge benötigt.
Lediglich sterile Pipetten und ein Kipprollmischer (10-30 U/min), z.B. pluriPlix von pluriSelect,
sind erforderlich. |
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Welche Umdrehungszahl ist für den Kipprollmischer
ideal und warum?
Die Umdrehungszahl des Kipprollenmischers kann sehr
variabel gewählt werden. In der Regel sind
in etwa 10 rpm ideal. Aber auch Umdrehungszahlen
von 5 rpm und 30 rpm sind möglich. Wenn eine
Mindestdurchmischung der Probe vorhanden ist (ca.
5 rpm), steht der erfolgreichen Isolation der Zielzellen
nichts im Wege. Bei einer zu schnellen Umdrehungszahl
kann es zu sehr hohen Strömungsgeschwindigkeiten
innerhalb des Probengemisches kommen. Dies kann
eine effektive Bindung von Ziel und Fängerpartikel
erschweren. In unserer Laborpraxis haben wir diese
Beobachtungen mit den handelsüblichen Kipprollenmischern
jedoch noch nicht gemacht. |
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15.
Wie lang dauert eine durchschnittliche Isolation
mit pluriSelect?
Weniger als eine Stunde! Die Separationsmethode
von pluriSelect ist schnell, sehr schnell im Vergleich
mit den auf dem Markt heute erhältlichen Systemen.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine Separation von
CD3-Zellen aus Vollblut in 58 Minuten abgeschlossen
ist. Die verkürzte Separationszeit liegt zum
großen Teil darin begründet, dass eine
Vorreinigung des Blutes (z.B. Ficoll Gradientenzentrifugation)
entfällt. Deshalb werden nur 6 Prozedurschritte
bis zur vollständigen Aufreinigungen der Zielzellen
benötigt. |
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16.
Welche Ausbeuten kann ich im Schnitt bei Ziel-Isolation
erwarten?
Im direkten Vergleich zu Systemen die eine Probenvorbereitung,
also Dichtegradientenzentrifugation voraussetzten,
ist die Ausbeute von pluriSelect Systemen den heutigen
Systemen weit überlegen. Die Kits sind so eingestellt,
dass durchschnittlich 70-80% der Zielzellen isoliert
werden. |
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17.
Welche Ausbeuten kann ich im Schnitt bei Ziel-Depletion
erwarten?
Das Separationsverfahren lässt aber auch die
Depletion von Zellen aus eine Probe (z.B. Vollblut)
zu. Dabei werden Ziele im Vollblut 'abgereichtert'.
Im Durchschnitt können 95% der Ziele aus einer
Probe depletiert werden. |
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Welche Reinheit haben meine isolierten Zellen?
Die durchschnittliche Reinheit der isolierten Zellen
liegt bei 95%. |
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19.
Kann ich einzelne Komponenten des Kits separat bestellen?
Ja, alle im Kit enthaltenen Einzelkomponenten können
direkt bei pluriSelect bestellt werden. |
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20.
Kann ich aus den gefangenen Zellen Nukleinsäuren
isolieren?
Ja, das ist besonders einfach! Nach der Zielisolation,
können die Zellen direkt auf dem Sieb mit handelsüblichen
Lysepuffern lysiert werden und die Nukleinsäuren
anschließend für die weitere Verarbeitung
aufbereitet werden. |
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21.
Wie kann ich die Separationskits bestellen?
Alle Kits können durch ein vollständig
ausgefülltes Formular bei pluriSelect per FAX
bestellt werden. |
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HINWEIS
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an support@pluriselect.de |
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